生命體的許多活動都離不開鈣離子（Ca2+）信號分子。細胞內鈣離子濃度的時空變化被稱之為鈣信號，它負責控制或調節(jié)各種細胞生命活動。開發(fā)靈敏和精準的鈣信號檢測工具（探針），對探究生命活動相關的信號機制和規(guī)律至關重要。目前在領域內被廣泛應用的鈣離子探針主要包括有機小分子類探針和遺傳編碼的（熒光）蛋白探針（genetically encodedCa2+indicators，GECIs）。

目前最被廣泛應用的單熒光GECI工具為GCaMPs系列，它由鈣感知和熒光反應兩大模塊組裝、構建而成。其中，鈣感知模塊包含鈣結合蛋白（如鈣調蛋白CaM）及其靶肽（如M13/RS20），產生熒光變化的模塊為環(huán)化重排的綠色熒光蛋白cpGFP（circularly permuted green fluorescent protein）（圖1A）。科學家們發(fā)現(xiàn)，通過改變CaM、M13與GFP三個元件之間的連接方式，或修飾連接短肽的氨基酸序列及改變互作界面中的關鍵氨基酸等方式，可改善GECIs的表現(xiàn)。因此，在2001年最初構建的GCaMP1上多次進行迭代改造后，2023年最新發(fā)展的GCaMP8系列已經具備了顯著改善的靈敏度和響應速度，但決定信噪比的響應幅度，即對鈣信號大小的分辨率和線性動態(tài)變化范圍，仍亟待提高。

(相關資料圖)

2023年4月20日，Nature Methods期刊在線發(fā)表了題為：Engineering of NEMO as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity的研究論文 。

該研究成果由北京師范大學認知神經科學與學習國家重點實驗室的章曉輝團隊、生命科學學院的王友軍團隊與中國科學技術大學的唐愛輝團隊合作完成。該研究開發(fā)構建了一類檢測鈣信號的新型熒光蛋白探針NEMOs，具有更強的熒光信號和更精準的定量測定性能。

北京師范大學的章曉輝團隊、王友軍團隊，聯(lián)合中國科學技術大學的唐愛輝團隊采用全新策略構建新型高靈敏鈣離子探針，從而增強GECI對鈣離子濃度變化的熒光響應幅度。團隊采用亮度更高的新型熒光蛋白mNeoGreen（mNG）來替換廣泛使用的cpGFP，結合多種設計及優(yōu)化策略組合，構建了含幾十個候選復合分子的GECI庫，并通過系統(tǒng)的鈣離子成像篩選和體外鑒定，最終獲得了一組名為NEMO的新型GECI探針（圖1B，包括NEMO-fast，NEMO-sensitive等）。

在研究過程中，解決了鎂離子結合降低mNG熒光信號、有效減弱mNG本底熒光信號等多個關鍵問題。與現(xiàn)有的GCaMP系列探針相比，NEMO探針的靈敏度及鈣響應幅度有了非常顯著的提升，在領域內首次實現(xiàn)了GECI探針對細胞內鈣信號超過100倍的響應幅度；同時具有更好的抗光淬滅能力與pH穩(wěn)定性，并能實現(xiàn)對鈣離子水平的絕對定量檢測。

圖1、單熒光遺傳編碼鈣探針（GECI）的常見構建方式。A) GCaMP方式；B）NEMO的構建方式。

合作團隊進一步在非興奮性細胞系（圖2A）、分離培養(yǎng)的大鼠神經元（圖2B）、小鼠腦內神經元在體雙光子激光成像（圖2C）和深部腦區(qū)光纖記錄等測試中發(fā)現(xiàn)，相比于最新或最廣泛使用的GCaMP8s或GCaMP6s，NEMO系列對胞內鈣信號的反應速度與之相當，但響應更靈敏且具更高的信噪比，同時響應幅度提高了約10倍之多。

綜上，該研究表明NEMO蛋白探針對胞內鈣信號或鈣依賴的細胞活動幅度具有更高的分辨率，可為檢測神經元活動及細胞鈣信號的時空變化提供一組性能更優(yōu)越的鈣信號探針。

圖2、NEMO鈣探針在（A）非興奮性細胞，（B）分離神經元及（C）小鼠在體腦神經元中的反應示例

相關主要NEMOs質粒可在Addgene平臺獲取，編號ID. 189930-189934。

本項工作受到國家基金委重大研究計劃、重點項目及面上項目、國家科技創(chuàng)新2030計劃、科技部重點研發(fā)計劃，以及博士后基金的支持。